Diferença chave – Tripsinização quente vs fria
A tripsinização a quente e a frio são dois métodos usados na desagregação enzimática de células em cultura de células animais. A principal diferença entre tripsinização quente e fria, como os nomes sugerem, depende da temperatura na qual a tripsina é adicionada para desagregação celular. A tripsinização a quente ocorre em condições de temperatura mais altas (36,5 – 37 0C), enquanto a tripsinização a frio ocorre em condições de baixa temperatura.
Durante o processo de cultivo celular primário de células animais, existem três métodos principais utilizados e provaram ser bem sucedidos. Os três métodos incluem desagregação mecânica de células, desagregação enzimática de células e a técnica de explante primário. A desagregação enzimática das células leva ao isolamento das células e é feita pela enzima degradadora de proteínas tripsina. Portanto, esse processo é conhecido como tripsinização. A tripsinização pode ser feita sob duas condições diferentes, nomeadamente tripsinização a quente e tripsinização a frio. A tripsinização quente é o método de tratamento das células com tripsina sob condições quentes a uma temperatura de 36,5 – 37 0C. A tripsinização a frio é o processo de tratamento com tripsina que ocorre em condições mais frias, preferencialmente em gelo, mantendo temperaturas muito baixas.
O que é Tripsinização Quente?
A tripsinização pode ser feita para desagregar os componentes celulares a fim de isolar as células para produzir uma cultura celular primária. A tripsina é uma enzima de degradação de proteínas, e a mistura enzimática usada na tripsinização pode ser um extrato bruto ou um produto purificado. Diz-se que o extrato bruto é mais eficiente na lise de proteínas e na desintegração celular, pois contém outras enzimas degradativas.
A tripsinização a quente é o método enzimático mais comumente usado para desagregação celular que ocorre sob condições de temperatura mais altas. Antes do tratamento por tripsinização, o tecido desejado é cortado em pedaços menores. Facilita o processo de desagregação fácil. O tecido picado é então lavado em um meio especial conhecido como meio de Dissecção de Sal Basal.
Ao completar a etapa de lavagem, as células são transformadas em um frasco contendo a enzima ativa, que é a tripsina. Como esta técnica implica um protocolo de tripsinização quente, a tripsina é colocada a uma temperatura em torno de 37 0C por cerca de quatro horas.
Figura 01: Tripsina
Os conteúdos são misturados e agitados usando métodos de centrifugação para facilitar o protocolo e acelerar o processo de desagregação. Uma vez atingido o tempo recomendado, as células podem ser derivadas do sobrenadante. As células derivadas do sobrenadante são então incubadas a uma determinada temperatura e tempo.
O que é Tripsinização a Frio?
A tripsinização a frio é o outro tipo de tripsinização que ocorre sob condições frias. Nesta técnica, as células que são picadas e lavadas são colocadas em frascos no gelo e depois embebidas com tripsina. O período de imersão é muito mais longo – cerca de 6 – 24 horas.
Após a conclusão do procedimento de imersão, a tripsina é removida do lisado celular e os pedaços de tecido são ainda incubados a 37 0C por cerca de 20 a 30 minutos. A desagregação das células é provocada por pipetagem repetida da mistura de tecidos. Isso permitirá que as células se dissociem da membrana e cheguem ao sobrenadante. Uma vez que as células estão no sobrenadante, elas são incubadas e cultivadas em uma temperatura e período de tempo desejados.
O método de tripsinização a frio tem várias vantagens
- Maior rendimento de células viáveis, pois o dano celular é minimizado. O dano celular é minimizado por não usar etapas de centrifugação.
- Método altamente conveniente.
- Menos trabalhoso.
A principal limitação do método de tripsinização a frio é que grandes quantidades não podem ser usadas em uma única instância.
Quais são as semelhanças entre tripsinização quente e fria?
- Os processos de tripsinização a quente e a frio usam a enzima tripsina para desagregação das células.
- Os processos de tripsinização a quente e a frio são usados em procedimentos de cultura de células para a desagregação de células.
- Em ambos os procedimentos de tratamento de tripsinização a quente e a frio, as células são derivadas do sobrenadante.
Qual é a diferença entre tripsinização quente e fria?
Tripsinização Quente vs Frio |
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| A tripsinização a quente é o método de tratamento das células com tripsina sob condições quentes a uma temperatura de 36,5 – 37 0. | Tripsinização a frio é o processo de tratamento com tripsina que ocorre em condições mais frias, preferencialmente em gelo mantendo temperaturas muito baixas. |
| Protocolo | |
| Os pedaços de tecido picados são mantidos a 37 0C continuamente durante todo o procedimento. | Os pedaços de tecido picados são inicialmente mantidos em temperaturas geladas e depois mantidos a 37 0. |
| Temperatura | |
| A tripsinização a quente ocorre em 36,5 – 37 0 | A tripsinização a frio ocorre em temperaturas geladas. |
| Tempo consumido | |
| Menor tempo necessário para todo o processo (cerca de 4 horas) de tripsinização quente. | Tempo mais longo (cerca de 6 a 24 horas) para tripsinização a frio. |
| Rendimento de Células Viáveis | |
| Baixa tripsinização quente. | Alta tripsinização a frio. |
| Uso de Centrifugação | |
| Centrifugação é necessária para desagregação de células em tripsinização quente. | A centrifugação não é necessária na tripsinização a frio. |
| Quantidade inicial de tecido para tripsinização | |
| Uma maior quantidade de tecido pode ser usada na tripsinização a quente. | Uma quantidade menor de tecido pode ser usada na tripsinização a frio. |
| Dano Celular | |
| Alta devido à centrifugação em tripsinização quente. | Menos devido à tripsinização a frio. |
Resumo – Tripsinização quente vs fria
Tripsinização é o método de utilização da enzima de degradação de proteínas tripsina para a desagregação e preparação de culturas de células primárias durante o processo de cultura de células. Existem duas técnicas principais de tripsinização com base nas temperaturas utilizadas durante o procedimento. São tripsinização quente e fria. A tripsinização a quente é realizada a 37 0C, enquanto a tripsinização a frio é realizada sob condições geladas. Embora a tripsinização a frio leve mais tempo para ser concluída, diz-se que ela tem um maior rendimento de células viáveis. Isso se deve ao fato de que o dano celular é minimizado na tripsinização a frio, pois não usa etapas de centrifugação vigorosas. Esta é a diferença entre tripsinização quente e fria.
