Key Difference – RT PCR vs QPCR
Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica usada para amplificar uma região específica do DNA in vitro. Devido à invenção desta técnica por Kary Mullis em 1983, os cientistas são capazes de fazer milhares a milhões de cópias de fragmentos de DNA específicos para fins de pesquisa. Atualmente tornou-se uma técnica comum e rotineiramente realizada em laboratórios clínicos e de pesquisa para uma ampla variedade de aplicações. Existem variações da técnica de PCR tradicional como RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, etc. RT PCR e Q PCR são duas importantes variações de PCR. A principal diferença entre o RT PCR e o Q PCR é que o RT PCR é usado para detectar a expressão gênica através da criação de transcrições de DNA complementar (cDNA) a partir do RNA, enquanto o Q PCR é usado para medir quantitativamente os produtos de PCR em tempo real usando corantes fluorescentes.
O que é RT PCR?
A reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT PCR) é uma variante da PCR que é usada para detectar a expressão de RNA. É um método muito importante para detectar a expressão de mRNA nos tecidos. RT PCR é empregado quando o material de partida da amostra é RNA. Na RT PCR, o mRNA molde é primeiro convertido em DNA complementar. Esta etapa é catalisada pela enzima transcriptase reversa e o processo é conhecido como transcrição reversa. Em segundo lugar, a PCR tradicional é empregada para o cDNA recém-sintetizado para a amplificação.
RT PCR é uma técnica altamente sensível que requer uma quantidade relativamente pequena de amostra de RNA. A RT PCR é comumente usada no diagnóstico e quantificação de espécies de RNA, especialmente vírus de RNA, como o vírus da imunodeficiência humana e o vírus da hepatite C.
Figura 01: Técnica de RT PCR
O que é QPCR?
PCR quantitativo (QPCR) é uma variante de PCR que é usada para medir quantitativamente os produtos de PCR. Também é referido como reação em cadeia da polimerase em tempo real, uma vez que mede a amplificação de tempo real usando máquina de PCR em tempo real. É um método adequado para determinar a quantidade de uma sequência alvo ou gene presente em uma amostra. A característica interessante do QPCR é que ele combina amplificação e quantificação verdadeira em uma única etapa. Portanto, a necessidade de eletroforese em gel na detecção pode ser eliminada pela técnica de QPCR. QPCR usa corantes fluorescentes para rotular produtos de PCR durante as reações de PCR que eventualmente levam à quantificação direta. Quando os produtos de PCR se acumulam, os sinais fluorescentes também são acumulados e serão medidos pela máquina em tempo real. QPCR pode ser combinado com RT PCR. É conhecido como RT – QPCR ou QRT – PCR e é considerado o método mais poderoso, sensível e quantitativo para detecção de níveis de RNA nas células ou tecidos.
SYBR Green e Taqman são dois métodos empregados para detectar ou observar o processo de amplificação da PCR em tempo real. O método SYBR Green é realizado usando um corante fluorescente chamado SYBR green e detecta a amplificação ligando-se ao corante para produzir DNA de fita dupla. O Taqman é realizado usando sondas duplamente marcadas e detecta a amplificação por degradação da sonda pela Taq polimerase e liberação do fluoróforo conforme mostrado na figura 02. Ambos os métodos monitoram o andamento do processo de amplificação e informam a quantidade do produto em tempo real.
PCR em tempo real tem uma ampla variedade de aplicações, como quantificação de expressão gênica, análise de microRNA e RNA não codificante, genotipagem de SNP, detecção de variantes de número de cópias, detecção de mutações raras, detecção de organismos geneticamente modificados, detecção de agentes infecciosos, etc.
Figura 02: Técnica de PCR quantitativa
Qual é a diferença entre RT PCR e QPCR?
RT PCR vs QPCR |
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| RT PCR é uma técnica usada para detectar a expressão gênica por amplificação. | QPCR é uma técnica que amplifica o DNA e quantifica os produtos da PCR em tempo real. |
| Envolvimento da enzima transcriptase reversa | |
| A transcriptase reversa enzimática é usada para RT PCR. | A transcriptase reversa enzimática não é usada para QPCR. |
| Uso de Moléculas Marcadas Fluorescentemente | |
| Corantes ou sondas marcadas com fluorescência não são usados para RT PCR. | Corantes ou sondas marcadas com fluorescência são usados para QPCR. |
| Quantificação do produto PCR | |
| A menos que acoplado com QPCR, RT PCR não quantifica o produto de PCR. | QPCR mede quantitativamente o produto de PCR. |
| Material Inicial | |
| O material inicial é mRNA. | O material inicial é o DNA. |
| Síntese de cDNA | |
| DNA complementar é produzido durante a RT PCR. | DNA complementar não é produzido durante QPCR. |
Resumo – RT PCR vs QPCR
RT PCR e QPCR são duas versões da PCR tradicional. A técnica de RT PCR é realizada para amostras de mRNA e é conduzida pela transcrição reversa e produção de cDNA. QPCR é usado para quantificar produtos de PCR durante os ciclos térmicos de PCR em tempo real usando corantes fluorescentes ou sondas marcadas. Na QPCR, a quantidade de produto da PCR é representada pelos sinais fluorescentes emitidos pela amostra. O RT PCR é popularmente usado como um processo de amplificação, enquanto o QPCR é comumente usado como um processo de quantificação. Esta é a diferença entre RT PCR e QPCR.
