A principal diferença entre os ensaios de PCR aninhados convencionais e em tempo real é que a PCR convencional é uma técnica desenvolvida para amplificar sequências específicas de DNA e a PCR aninhada é uma modificação da PCR convencional que consiste em duas reações de amplificação sequenciais, enquanto a PCR real -time PCR é uma variante da PCR convencional capaz de quantificar o produto amplificado.
PCR é uma técnica científica muito comum amplamente utilizada em pesquisa e medicina para detectar DNA. Os testes de PCR são usados para detectar antígenos detectando seu DNA ou RNA. Geralmente, o RNA viral está presente no corpo antes de detectar anticorpos ou apresentar os sintomas da doença. Um teste de PCR pode dizer se alguém tem ou não o vírus desde o início. Atualmente, o PCR é o teste padrão para detectar a doença COVID-19. Existem diferentes tipos de técnicas de PCR, como PCR em tempo real, PCR aninhado, PCR multiplex, PCR de inicialização a quente e PCR de longo alcance, etc.
O que são ensaios de PCR convencionais?
O ensaio de PCR convencional é uma técnica de amplificação de DNA in vitro realizada rotineiramente em laboratórios de biologia molecular. Este método permitiu a produção de milhares a milhões de cópias de um determinado fragmento de DNA. Kary Mullis introduziu esta técnica em 1980. Esta técnica requer um fragmento de DNA conhecido como molde para fazer muitas cópias dele. A Taq polimerase funciona como a enzima DNA polimerase e catalisa a síntese de novas fitas da sequência molde.
Primers na mistura de PCR funcionarão como pontos de partida para as extensões dos fragmentos. Todos os ingredientes necessários para fazer cópias de DNA estão incluídos na mistura de PCR. A reação de PCR é executada em uma máquina de PCR e deve ser alimentada com a mistura de PCR correta e o programa de PCR correto. Se a mistura de reação e o programa estiverem corretos, ele produzirá o número necessário de cópias de uma determinada seção de DNA a partir de uma quantidade muito pequena de DNA.
Figura 01: Ensaio de PCR convencional
Existem três etapas principais envolvidas em uma reação de PCR: desnaturação, hibridização do primer e extensão da fita. Essas três etapas ocorrem em três temperaturas diferentes. O tampão de PCR mantém as condições ideais para a ação da Taq polimerase. Esses três estágios da reação de PCR são repetidos para produzir a quantidade necessária do produto de PCR. A cada reação de PCR, o número de cópias de DNA dobra. Assim, a amplificação exponencial pode ser observada na PCR. O produto de PCR pode ser resolvido usando eletroforese em gel, pois produz uma quantidade visível de DNA em um gel e pode ser purificado para estudos posteriores, como sequenciamento.
PCR é uma ferramenta valiosa na pesquisa médica e biológica. Especialmente em estudos forenses, a PCR tem um valor imenso, pois pode amplificar o DNA para estudos a partir de pequenas amostras dos criminosos e fazer perfis de DNA forense. A PCR é amplamente utilizada em muitas áreas da biologia molecular, incluindo genotipagem, clonagem de genes, detecção de mutações, sequenciamento de DNA, microarranjos de DNA e testes de paternidade.
O que são ensaios de PCR aninhados?
Nested PCR é um tipo de PCR que reduz a amplificação não específica do DNA. Existem duas PCRs sucessivas ou duas reações de amplificação sequenciais no ensaio de PCR nested. Durante a primeira reação de amplificação, um produto de PCR é produzido. Após a primeira reação, uma segunda reação de amplificação é realizada no produto de PCR da primeira reação. Portanto, os primers na segunda mistura de reação se ligam ao primeiro produto de PCR e o amplificam.
Figura 02: PCR aninhado
Os pares de primers são diferentes em cada reação. A ligação não específica de primers é reduzida em nested PCR. Os ensaios de PCR aninhados são úteis para aumentar a sensibilidade e/ou especificidade. No entanto, a PCR aninhada requer conhecimento sobre a sequência interessada.
O que são ensaios de PCR em tempo real?
PCR em tempo real ou PCR quantitativo (Q PCR) é uma versão modificada do PCR que mede os produtos de PCR quantitativamente. Portanto, esta técnica quantifica a amplificação em tempo real usando uma máquina de PCR em tempo real. É também um método adequado para determinar a quantidade de uma sequência alvo ou gene presente em uma amostra.
A característica interessante da PCR em tempo real é que ela combina amplificação e quantificação verdadeira em uma única etapa. Portanto, a necessidade de eletroforese em gel para detecção pode ser eliminada pela técnica de PCR em tempo real. O uso de corantes fluorescentes para rotular produtos de PCR durante as reações de PCR acabará por levar à quantificação direta. Quando os produtos de PCR são acumulados, os sinais fluorescentes também são acumulados e serão medidos pela máquina em tempo real. SYBR Green e Taqman são dois métodos para detectar ou observar o processo de amplificação da PCR em tempo real. Ambos os métodos monitoram o andamento do processo de amplificação e informam a quantidade do produto em tempo real.
Figura 03: PCR em Tempo Real
A PCR em tempo real tem uma ampla variedade de aplicações, como quantificação de expressão gênica, análise de microRNA e RNA não codificante, genotipagem de SNP, detecção de variantes de número de cópias, detecção de mutações raras, detecção de organismos geneticamente modificados e detecção de agentes infecciosos.
Quais são as semelhanças entre os ensaios de PCR aninhados convencionais e em tempo real?
- Ensaios de PCR aninhados e em tempo real são modificações do ensaio de PCR convencional.
- Todas as três técnicas amplificam amostras de DNA.
- Seus produtos podem ser usados em sequenciamento ou análise.
- Estes ensaios requerem primers.
Qual é a diferença entre ensaios de PCR aninhados convencionais e em tempo real?
PCR convencional é uma técnica desenvolvida para amplificar sequências específicas de DNA. Já a Nested PCR é uma modificação da PCR convencional que consiste em duas reações de amplificação sequenciais, e a PCR em tempo real é uma variante da PCR convencional capaz de quantificar o produto amplificado. Portanto, esta é a principal diferença entre os ensaios convencionais de PCR aninhados e em tempo real. Ao contrário da PCR convencional e em tempo real, a PCR aninhada usa dois conjuntos de primers. Além disso, há duas reações de amplificação sucessivas na nested PCR para reduzir a amplificação não específica. além disso, os ensaios de PCR convencional e em tempo real não contêm duas reações de amplificação sequenciais.
O infográfico a seguir lista as diferenças entre os ensaios convencionais de PCR aninhados e em tempo real em forma de tabela para comparação lado a lado.
Resumo – Ensaios de PCR convencionais vs aninhados vs em tempo real
PCR convencional é a primeira técnica desenvolvida para amplificar fragmentos específicos de DNA. A PCR aninhada e a PCR em tempo real são duas variantes da PCR convencional. Existem duas reações de amplificação sequenciais e o uso de dois conjuntos de primers na nested PCR. A PCR em tempo real é desenvolvida para quantificar o produto amplificado da PCR. Assim, isso resume a diferença entre os ensaios convencionais de PCR aninhados e em tempo real.
