A principal diferença entre Golden Gate e Gibson Assembly é que Golden Gate depende da presença de sítios de restrição dentro de uma determinada sequência a ser clonada, enquanto Gibson Assembly não depende da presença de sítios de restrição dentro de uma determinada sequência para ser clonado.
Ao longo das últimas décadas, os cientistas moleculares desenvolveram vários procedimentos padronizados que permitem a montagem mais fácil de vários fragmentos de DNA em uma única peça. Portanto, métodos de clonagem como Ligação de Enzimas de Restrição, Clonagem de Gateway, Montagem de Gibson, Montagem de Golden Gate e Clonagem de TOPO são amplamente utilizados por pesquisadores em experimentos científicos. Portanto, Golden Gate e Gibson Assembly são dois métodos de clonagem molecular que permitem a montagem de vários fragmentos de DNA em uma única peça.
O que é a Assembléia Golden Gate?
Golden Gate é um método de clonagem molecular que facilita a montagem de vários fragmentos de DNA em uma única peça. Este método baseia-se na presença de sítios de restrição dentro de uma determinada sequência a ser clonada. Originou-se em 1996. Esta técnica utiliza enzimas de restrição do tipo IIS e T4 DNA ligase. Essas enzimas cortam o DNA fora dos locais de reconhecimento. Eles podem criar saliências não palindrômicas. Portanto, vários fragmentos de DNA podem ser montados usando combinações de sequências salientes.
Figura 01: Golden Gate
Procedimento de montagem do Golden Gate
A técnica Golden Gate tem três etapas principais em seu procedimento:
- criação de saliências no vetor de clonagem,
- montagem de múltiplas inserções de DNA usando sequências específicas de fragmentos em saliências e
- ligação.
Golden Gate assembly usa vetores de clonagem circulares (vetor de destino). Além disso, neste método, o sítio de restrição é eliminado do produto ligado para realizar a digestão e a ligação simultaneamente. Um protocolo de ciclo térmico típico para Golden Gate oscila entre 37 °C e 16 °C porque 37 °C é ideal para enzimas de restrição e 16 °C é ideal para ligases.
O que é montagem Gibson?
Gibson Assembly é um método de clonagem molecular que permite a montagem de vários fragmentos de DNA em uma única peça. Ao contrário do método Golden Gate, este método não depende da presença de sítios de restrição dentro de uma determinada sequência a ser clonada. Foi encontrado por Daniel G. Gibson do Instituto J. Craig Venter. Esta técnica é um tipo de método de clonagem independente de sequência e ligase (SLIC).
Figura 02: Montagem Gibson
Procedimento de montagem da Gibson
Gibson Assembly precisa de fragmentos de DNA contendo 20-40 pares de bases sobrepostos a fragmentos de DNA adjacentes. As sobreposições são adicionadas via PCR. Em seguida, esses fragmentos de DNA são adicionados à mistura de maser Gibson que possui três enzimas. Este procedimento é realizado em condições isotérmicas (50°C por 1 hora) usando três enzimas diferentes: exonuclease, DNA polimerase e DNA ligase. A exonuclease mastiga de volta o DNA da extremidade 5'. Assim, não inibe a atividade da polimerase e permite que a reação prossiga em um único processo. As regiões de fita simples resultantes em fragmentos de DNA adjacentes podem ser hibridadas devido a sequências de sobreposição. A DNA polimerase preenche as lacunas adicionando nucleotídeos. Finalmente, a DNA ligase une-se covalentemente ao DNA de segmentos adjacentes. Normalmente, o Gibson Assembly usa vetores de destino linearizados. Além disso, este método pode combinar simultaneamente até 15 fragmentos de DNA com base na semelhança de sequência.
Semelhanças entre Golden Gate e Gibson Assembly
- Golden Gate e Gibson Assembly são dois métodos de clonagem molecular.
- Ambos os métodos podem reunir vários fragmentos de DNA em uma única peça.
- Esses métodos usam vetores de destino.
- Ambos os métodos utilizam termocicladores para a montagem de múltiplos fragmentos de DNA.
- Eles são usados em mutagênese direcionada ao local.
Diferença entre Golden Gate e Gibson Assembly
Golden Gate é um método de clonagem molecular usado na montagem de múltiplos fragmentos de DNA em uma única peça contando com a presença de sítios de restrição dentro de uma determinada sequência a ser clonada, enquanto Gibson Assembly é um método de clonagem molecular usado na montagem de múltiplos fragmentos de DNA em uma única peça sem depender da presença de sítios de restrição dentro de uma determinada sequência a ser clonada. Esta é a principal diferença entre Golden Gate e Gibson Assembly. Além disso, o método Golden Gate usa um vetor de destino circular, enquanto o método Gibson Assembly usa um vetor de destino linearizado.
O infográfico a seguir tabula a diferença entre Golden Gate e Gibson Assembly.
Resumo – Golden Gate vs Gibson Assembly
A clonagem molecular é um método usado para montar moléculas de DNA recombinante e direcionar sua replicação dentro de organismos hospedeiros. Golden Gate e Gibson Assembly são dois métodos de clonagem molecular que permitem a montagem de vários fragmentos de DNA em uma única peça. O método Golden Gate depende da presença de sítios de restrição dentro de uma determinada sequência a ser clonada, enquanto o Gibson Assembly não depende da presença de sítios de restrição dentro de uma determinada sequência a ser clonada. Assim, esta é a principal diferença entre Golden Gate e Gibson Assembly.
