Key Difference – Nick Translation vs Primer Extension
Tradução de Nick e extensão de primers são duas técnicas importantes realizadas em Biologia Molecular. A principal diferença entre a tradução de nick e a extensão do primer é que o processo de tradução do nick produz sondas marcadas para outras técnicas de hibridização, enquanto o método de extensão do primer identifica uma sequência de RNA específica de uma mistura e revela informações sobre a expressão do mRNA. Ambas as técnicas têm grande importância e são realizadas rotineiramente em laboratórios de pesquisa molecular.
O que é Nick Translation?
A tradução de Nick é uma técnica importante usada para preparar sondas marcadas para várias técnicas de biologia molecular, como blotting, hibridização in situ, hibridização in situ fluorescente etc. É um método in vitro de marcação de DNA. As sondas de DNA são usadas para identificar sequências específicas de DNA ou RNA. Com a ajuda de uma sonda marcada, fragmentos específicos podem ser marcados ou visualizados a partir de uma mistura complexa de ácido nucleico. Portanto, as sondas marcadas são preparadas usando várias técnicas para serem usadas para diferentes técnicas. A tradução de Nick é um desses métodos que produz sondas marcadas com a ajuda das enzimas DNase 1 e DNA polimerase 1.
O processo de tradução de nick começa com a atividade da enzima DNase 1. A DNase 1 introduz cortes no esqueleto de fosfato do DNA de fita dupla clivando as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos. Uma vez que o corte é criado, o grupo OH 3' livre do nucleotídeo será produzido e a enzima DNA polimerase 1 atuará sobre ele. A atividade de exonuclease 5' para 3' da DNA polimerase 1 remove nucleotídeos do corte em direção à direção 3' da fita de DNA. Simultaneamente, a atividade da polimerase da enzima DNA polimerase 1 funciona e adiciona nucleotídeos para substituir os nucleotídeos removidos. Se os nucleotídeos estiverem marcados, a substituição ocorrerá pelos nucleotídeos marcados e marcará o DNA para identificação. Este DNA marcado recém-sintetizado pode ser usado como sondas em várias reações de hibridização em Biologia Molecular.
Figura 01: Processo de tradução de Nick
O que é extensão Primer?
A extensão do primer é uma técnica que é usada para encontrar a sequência de RNA específica de uma mistura de RNA e localizar a extremidade 5' do transcrito de mRNA. Também é usado para estudar a estrutura do RNA e sua expressão. O método de extensão do primer é realizado com primers marcados ou com nucleotídeos marcados. Se forem usados primers marcados, isso exclui a necessidade de marcar os nucleotídeos que são usados para a síntese de cDNA. Existem várias etapas nesta técnica. Começa com a extração de RNA da amostra. Em seguida, um oligonucleotídeo iniciador marcado é adicionado à mistura juntamente com os ingredientes necessários para sintetizar o cDNA de uma sequência de RNA específica. O primer hibridiza com a sequência complementar da mistura. Usando a sequência hibridada do primer como molde, a enzima transcriptase reversa sintetiza o DNA complementar (cDNA) da sequência de RNA. O emparelhamento do primer e a transcrição reversa ocorrem apenas quando a sequência de RNA específica está presente na amostra. Finalmente, quando a eletroforese em gel desnaturante é realizada, o tamanho da sequência de RNA pode ser determinado. Também é fácil encontrar a base +1 da sequência de mRNA (sítio de iniciação da transcrição) pelo método de extensão do primer. A quantidade de mRNA presente na amostra pode ser quantificada por este método se for usado primer em excesso.
Figura 02: Extensão do primer
Qual é a diferença entre Nick Translation e Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
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| A tradução de Nick é um processo que cria sondas de DNA marcadas para várias reações de hibridização. | A extensão do primer é uma técnica usada para encontrar RNA específico ou para estudar a expressão gênica. |
| Enzimas Usadas | |
| DNase 1 e enzimas DNA polimerase são usadas. | A enzima transcriptase reversa é usada. |
| Importância | |
| A tradução de Nick facilita a marcação de uma sequência de DNA específica. | A extensão do primer permite a detecção do tamanho específico da sequência de mRNA e da quantidade presente na amostra. |
Resumo – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translation é um método usado para sintetizar sondas marcadas com base nas atividades das enzimas DNase 1 e E coli DNA polimerase 1. É um método in vitro empregado nos laboratórios antes de diferentes técnicas de hibridização. Durante a tradução do corte, a atividade da exonuclease 5'-3' da DNA polimerase 1 remove nucleotídeos antes do corte e a atividade da polimerase da DNA polimerase 1 substitui os nucleotídeos removidos por nucleotídeos marcados atrás do corte. A extensão do primer é um método que é usado para detectar um transcrito de RNA específico de uma mistura e quantificar o tamanho e a quantidade do RNA de interesse. Esta é a diferença entre a tradução de nick e a extensão do primer.
