A principal diferença entre nick translation e end fill é que nick translation é um processo que cria sondas de DNA marcadas para várias reações de hibridização, enquanto end fill é uma técnica que cria fragmentos embotados adicionando nucleotídeos em saliências de fita simples.
Tradução de Nick e preenchimento final são duas técnicas usadas em biologia molecular. A tradução de Nick é usada para marcar sondas para hibridização para detectar sequências de nucleotídeos específicas. O preenchimento de extremidade é usado para fazer fragmentos embotados que tinham extremidades adesivas com saliências de fita simples. Ambas as técnicas têm grande importância e são realizadas rotineiramente em laboratórios de pesquisa molecular.
O que é Nick Translation?
Nick translation é uma técnica importante usada para preparar sondas marcadas para várias técnicas de biologia molecular, como blotting, hibridização in situ, hibridização in situ fluorescente, etc. É um método in vitro de marcação de DNA. As sondas de DNA são usadas para identificar sequências específicas de DNA ou RNA. Com a ajuda de uma sonda marcada, fragmentos específicos podem ser marcados ou visualizados a partir de uma mistura complexa de ácido nucleico. Portanto, as sondas marcadas são preparadas usando várias técnicas. A tradução de Nick é um desses métodos que produz sondas marcadas com a ajuda das enzimas DNase 1 e DNA polimerase 1.
Figura 01: Tradução de Nick
O processo de tradução de Nick começa com a atividade da enzima DNase 1. A DNase 1 introduz cortes no esqueleto de fosfato do DNA de fita dupla clivando as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos. Uma vez que o corte é criado, o grupo 3'OH livre do nucleotídeo será produzido e a enzima DNA polimerase 1 atuará sobre ele. A atividade de exonuclease 5' para 3' da DNA polimerase 1 remove nucleotídeos do corte na direção 3' da fita de DNA.
Simultaneamente, a atividade da polimerase da enzima DNA polimerase 1 funciona e adiciona nucleotídeos para substituir os nucleotídeos removidos. Se os nucleotídeos estiverem marcados, a substituição ocorrerá pelos nucleotídeos marcados e marcará o DNA para identificação. Finalmente, este DNA marcado recém-sintetizado pode ser usado como sondas em várias reações de hibridização.
O que é preenchimento final?
End fill é uma técnica usada em biologia molecular para fazer fragmentos embotados. A digestão de restrição produz fragmentos com saliências. Esses fragmentos podem não ser compatíveis para ligar em vetores plasmídicos. Os vetores são frequentemente embotados para permitir que extremidades não compatíveis sejam unidas. Portanto, fragmentos com saliências podem ser embotados adicionando os nucleotídeos à fita complementar usando a saliência como modelo para polimerização. Este processo é conhecido como preenchimento final.
DNA polimerases como o fragmento Klenow da DNA Polimerase I e T4 DNA Polimerase catalisam o preenchimento final. Eles adicionam nucleotídeos para preencher (5′ → 3′) e mastigar de volta (3′ → 5′). Uma vez que as extremidades adesivas são preenchidas, elas se tornam rombas e estão prontas para serem ligadas em um vetor.
Além disso, o preenchimento final pode ser usado para rotular moléculas de DNA. No entanto, ele só pode ser usado para rotular moléculas de DNA com extremidades pegajosas. Em comparação com a tradução de nick, o preenchimento final é um método mais suave que raramente causa quebras de DNA.
Quais são as semelhanças entre Nick Translation e End Filling?
- Tanto a tradução de nick quanto o preenchimento final são técnicas de biologia molecular.
- Eles podem ser usados para rotular sondas.
- Ambos são in vitro
Qual é a diferença entre Nick Translation e End Filling?
Nick translation é uma técnica que cria sondas marcadas para hibridização. Em contraste, o preenchimento final é uma técnica que cria fragmentos sem corte para ligação em vetores. Então, esta é a principal diferença entre a tradução de nicks e o preenchimento final. Além disso, a tradução de Nick requer o uso de atividade de exonuclease de 5' a 3', enquanto o preenchimento final não requer atividade de exonuclease de 5' a 3'.
O infográfico abaixo tabula as diferenças entre a tradução de nicks e o preenchimento final com mais detalhes.
Resumo – Nick Translation vs End Filling
Nick translation é um método que incorpora nucleotídeos radiomarcados no DNA. Sintetiza sondas marcadas com base nas atividades das enzimas DNase 1 e E. coli DNA polimerase 1. O preenchimento final, por outro lado, é uma técnica que produz fragmentos rombos. Quando os fragmentos têm extremidades aderentes (single-stranded overhangs), é necessário torná-las extremidades rombas para ligar em vetores. O preenchimento de extremidade adiciona nucleotídeos compatíveis e cria fragmentos de extremidade sem corte para torná-los compatíveis para ligação. Assim, isso resume a diferença entre a tradução de nicks e o preenchimento final.
