Key Difference – Clonagem de genes vs PCR
A síntese de muitas cópias de DNA a partir de um fragmento de DNA específico é chamada de amplificação de DNA. Existem dois processos principais de amplificação de DNA, a saber, a clonagem de genes e a PCR. A principal diferença entre a clonagem de genes e a PCR é que a clonagem de genes produz as múltiplas cópias de um gene específico in vivo, construindo um DNA recombinante e crescendo dentro de uma bactéria hospedeira, enquanto a PCR produz milhões de cópias de um fragmento de DNA específico in vitro, passando por repetidos ciclos de desnaturação e síntese.
O que é clonagem de genes?
A clonagem de genes é uma técnica empregada para localizar e multiplicar um gene específico a partir do DNA genômico extraído de um organismo através da construção de DNA recombinante. O DNA genômico contém milhares de genes diferentes codificados para proteínas. Quando o DNA é extraído, ele inclui todos os genes possíveis que ele pode carregar. A técnica de clonagem de genes permitiu a detecção de um gene específico a partir do DNA total. Portanto, a clonagem de genes serve como uma ferramenta importante na biologia molecular.
Fazer uma biblioteca genômica de um organismo é essencial na clonagem de genes se não houver nenhuma pista sobre a localização do gene relevante no DNA. Uma biblioteca genômica é feita usando os seguintes passos.
Passo 1: Extração do DNA total de um organismo que contém o gene desejado.
Passo 2: Digestão de restrição do DNA extraído para produzir pequenos fragmentos gerenciáveis. Esta etapa é facilitada por endonucleases de restrição.
Passo 3: Seleção de um vetor adequado e abertura do DNA do vetor usando as mesmas endonucleases de restrição. Plasmídeos bacterianos são comumente usados como vetores para transportar DNA estranho. Plasmídeos são pequenos círculos de DNA localizados dentro de bactérias.
Passo 4: Combinação do DNA vetorial e DNA fragmentado para produzir molécula de DNA recombinante. Esta etapa é governada pela DNA ligase.
Passo 5: Transferência de moléculas de DNA recombinante em bactérias hospedeiras. Esta etapa é conhecida como transformação e é feita usando um choque térmico.
Passo 5: Triagem de células bacterianas transformadas em meio de cultura. Uma população mista de células hospedeiras transformadas e não transformadas é obtida no final do processo de transformação. Como gene de interesse inclui apenas em células hospedeiras transformadas. Portanto, é necessário selecionar células transformadas. A seleção é feita usando meios seletivos que contêm antibióticos. Apenas as células transformadas crescem neste meio de triagem permitindo a seleção.
Passo 6: Crescimento de bactérias para produzir uma biblioteca de genes. Nesta etapa, as células hospedeiras transformadas são introduzidas em meios de cultura frescos que fornecem requisitos de crescimento ótimos. O total de colônias nas placas de cultura representa a biblioteca genômica desse organismo.
Passo 7: A molécula de DNA recombinante contendo o gene de interesse deve ser rastreada a partir de milhares de fragmentos clonados de DNA recombinante. Isso pode ser realizado pelo uso de sondas que marcam o gene específico ou os resultados específicos da proteína desse gene.
Uma vez que o gene interessado contendo a colônia bacteriana é identificado a partir do total de colônias, é possível fazer milhões de cópias do plasmídeo recombinante que contém o gene.
A clonagem de genes é usada para estabelecer bibliotecas de genes, produzir proteínas especiais, vitaminas, antibióticos, hormônios, sequenciar e mapear genomas dos organismos, fazer múltiplas cópias de DNA de indivíduos em medicina forense, etc.
Figura_1: Clonagem de genes
O que é PCR?
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica que gera um grande número de cópias de um determinado fragmento de DNA. A amplificação exponencial de uma sequência de DNA específica é obtida por PCR em condições in vitro. Esta técnica é uma ferramenta muito poderosa em Biologia Molecular, pois pode multiplicar uma pequena amostra de DNA em uma quantidade utilizável. A PCR foi introduzida por Kary Mullis em 1983 e esta invenção premiada criou um grande avanço na Biologia Molecular.
A técnica de PCR segue reações de PCR repetidas conforme mostrado na Figura 02. Uma reação de PCR consiste em três etapas principais ocorrendo em três temperaturas diferentes; desnaturação de fita dupla no DNA a 94 0C, hibridização de primers em 68 0C e alongamento da fita em 72 0 C. Portanto, quando a PCR é realizada, a flutuação de temperatura deve ser altamente mantida para uma replicação adequada. A PCR é realizada em uma máquina de PCR dentro de tubos de PCR. Os tubos de PCR são carregados com misturas de PCR corretas contendo DNA modelo, Taq polimerase, primers, dNTPs e tampão. A desnaturação da amostra de DNA de fita dupla em DNA de fita simples é feita quebrando as ligações de hidrogênio entre as bases complementares em 94 – 98 0C. Em seguida, fitas simples de DNA molde são expostas para primers. Um par de primers (para frente e para trás) deve ser fornecido, e eles devem ser termoestáveis para tolerar altas temperaturas. Os primers são sequências curtas de DNA de fita simples complementares às extremidades do fragmento de DNA alvo. Os primers sintéticos são usados em PCR. Os primers se ligam às bases complementares do DNA da amostra e iniciam a síntese de uma nova fita. Essa etapa é catalisada por uma enzima chamada Taq polimerase; uma enzima polimerase de DNA termoestável isolada de Thermus auqaticus. Quando primers e nucleotídeos (blocos de construção) estão disponíveis, a Taq polimerase constrói a nova fita de DNA complementar ao DNA molde. No final do programa de PCR, o fragmento de DNA amplificado é observado usando eletroforese em gel. Se for necessária mais análise, o produto de PCR é purificado a partir do gel.
PCR é muito útil para diagnóstico e monitoramento de doenças genéticas e adquiridas, identificação de criminosos (na área forense), estudo da estrutura e função de um segmento alvo de DNA, sequenciamento e mapeamento de genomas de organismos, etc. A PCR tornou-se uma técnica laboratorial de rotina em laboratórios de pesquisa médica e de biologia molecular entre os cientistas, uma vez que tem uma ampla variedade de aplicações.
Figura_2: Reação em Cadeia da Polimerase
Qual é a diferença entre clonagem de genes e PCR?
Clonagem de genes vs PCR |
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| Clonagem de genes é o processo de fazer várias cópias de um gene específico in vivo através de DNA recombinante e transformar em uma bactéria hospedeira. | A técnica de PCR produz múltiplas cópias de uma determinada sequência de DNA in vitro através de ciclos repetidos de reações de PCR. |
| Requisito de Construção de DNA Recombinante | |
| DNA recombinante é produzido para localizar o gene. | DNA recombinante não é produzido. |
| Necessidade de mão de obra | |
| Este processo é trabalhoso. | Trabalho intensivo não é necessário. |
| Processo in vivo ou in vitro | |
| A construção do DNA recombinante é in vitro e a amplificação do DNA é in vivo. | A amplificação do DNA acontece completamente in vitro. |
Resumo – Clonagem de genes vs PCR
Clonagem de genes e PCR são dois métodos usados para amplificação de DNA. PCR é um processo in vitro que faz múltiplas cópias de DNA de um fragmento de DNA particular sem usar DNA recombinante e um organismo hospedeiro. A clonagem de genes é principalmente um processo in vivo que resulta em múltiplas cópias de um gene interessado dentro do organismo hospedeiro através da construção de DNA recombinante. Esta é a diferença entre clonagem de genes e PCR.
