Key Difference – Primers de PCR vs Primers de sequenciamento
Com os recentes desenvolvimentos no campo da biologia molecular, foram desenvolvidas diferentes técnicas genéticas que tornaram fáceis e precisos os processos de investigação das diversas vertentes do assunto. PCR e outros procedimentos de sequenciamento são duas técnicas importantes. Eles usam diferentes subcomponentes. Os primers são considerados o principal subcomponente comum às técnicas de PCR e Sequenciamento. Os primers de PCR são usados para amplificação de uma determinada sequência de DNA, enquanto os primers de sequenciamento são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua ordem específica da sequência de nucleotídeos. Esta é a principal diferença entre os primers de PCR e os primers de sequenciamento.
O que são primers de PCR?
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica genética que é utilizada no campo da biologia molecular para amplificar uma ou poucas cópias de um determinado segmento de DNA e obter muitos milhões de cópias idênticas. Em uma reação de PCR, diferentes componentes são usados, incluindo primers. Os primers são fitas curtas de DNA com comprimento de nucleotídeo de 18-25, tornando-as compatíveis com a região inicial e final dos fragmentos de DNA a serem amplificados. Os primers podem ser um primer direto e um primer reverso. Esses primers se ligam ao fragmento de DNA nos pontos específicos onde faz a DNA polimerase se ligar ao primer específico no local e iniciar a síntese da nova fita de DNA.
A seleção de primers é um aspecto importante do processo de PCR. A seleção do comprimento do primer é importante. O comprimento ideal seria 18-25 nucleotídeos. Se o comprimento for muito curto ou muito longo, os primers não se ligarão à sequência de DNA a ser amplificada com precisão. Primers que são muito curtos em comprimento levam ao anelamento não específico do primer em diferentes locais da sequência de DNA.
Figura 01: Primers de PCR
O teor de Guanina e Citosina (GC) em um bom primer deve estar na faixa de 40-60. A temperatura de recozimento do primer e a temperatura de fusão são fatores vitais durante a PCR. A temperatura de fusão deve ser calculada com precisão, e a temperatura de recozimento do primer deve ser 5 0C menor que a temperatura de fusão. A temperatura de fusão deve ser de 60 °C e 75 °C. Temperaturas muito altas ou muito baixas resultarão em atividade menos ativa da DNA polimerase.
O que são primers de sequenciamento?
Primers de sequenciamento são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. Para obter bons resultados de sequenciamento, primers e templates de alta qualidade são importantes. Assim, quando os primers são selecionados, eles devem ser exclusivos de uma região específica onde desejamos sequenciar. Também deve estar com uma orientação correta onde as sequências são geralmente geradas das extremidades 3' a 5' dos primers. A sequência não deve ter auto-hibridização indesejável, como a formação de alças em gancho. Não deve conter formação consecutiva de bases Guanina.
A temperatura de fusão (Tm) do primer deve ser adequada às condições do sequenciamento. Portanto, deve estar entre 52oC e 74oC. A preparação de oligonucleotídeos a serem usados como primer deve ser purificada para obter o comprimento total desejado da sequência. Se os oligonucleotídeos contiverem impurezas, a sinalização da sequência iniciadora será sobreposta a partir de diferentes sítios de iniciação e também diminuirá o número de células de base.
Figura 02: Primers de sequenciamento
A temperatura de fusão do primer (Tm) de um oligonucleotídeo determina quão forte as fitas de DNA complementares são hibridizadas entre si. Tm pode ser considerado como um cálculo termodinâmico onde depende tanto das sequências de DNA quanto de várias condições, como a concentração de sal. A Tm é importante durante a PCR, onde uma variante chamada de sequenciamento de ciclo é usada para produzir um grupo de fragmentos terminados em didesoxinucleotídeos. Aqui, o primer que é sequenciado será inicialmente hibridizado alternativamente, depois estendido e por último desnaturado para amplificação. Portanto, o valor de Tm deve estar entre 52oC e 74o C. Os oligonucleotídeos sintetizados podem ser obtidos em laboratórios de síntese de DNA/RNA conforme escolha. A pequena escala de síntese que é usada para sequenciamento de DNA é geralmente 50 nmol. Além disso, o mais importante, os primers usados para o sequenciamento devem ser purificados para ficarem livres de impurezas que impedirão a redução da qualidade.
Quais são as semelhanças entre os primers de PCR e os primers de sequenciamento?
- Ambos os primers de PCR e os primers de sequenciamento são primers usados no processo de amplificação de uma sequência de DNA direcionada.
- Tanto os primers de PCR quanto os primers de sequenciamento são compostos de nucleotídeos.
- Ambos os primers de PCR e os primers de sequenciamento são oligômeros curtos.
Qual é a diferença entre primers de PCR e primers de sequenciamento?
PCR Primers vs Sequencing Primers |
|
| Os primers de PCR são fitas curtas de DNA com um comprimento de sequência de nucleotídeos de 18-25, tornando-os compatíveis com a região inicial e final dos fragmentos de DNA a serem amplificados. | Primers de sequenciamento são oligômeros curtos que são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. |
| Função | |
| Primers de PCR são usados para amplificação de uma determinada sequência de DNA. | Primers de sequenciamento são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. |
| Número de primers necessários | |
| Dois primers; um primer direto e um primer reverso são usados como primers de PCR. | Precisa de apenas um primer como primer de sequenciamento. |
Resumo – PCR Primers vs Sequencing Primers
Primers de sequenciamento são usados no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. Um primer de sequenciamento será suficiente para executar o processo. Para obter bons resultados de sequenciamento, primers e modelos de alta qualidade são importantes. Assim, quando os primers são selecionados, eles devem ser exclusivos de uma região específica onde desejamos sequenciar. Os primers de PCR são fitas curtas de DNA com um comprimento de nucleotídeo de 18-25 que é compatível com a região inicial e final dos fragmentos de DNA a serem amplificados. Os primers de PCR podem ser um primer direto e um primer reverso. O teor de Guanina e Citosina (GC) em um bom primer deve estar na faixa de 40-60. A temperatura de recozimento do primer e a temperatura de fusão são aspectos vitais durante a PCR. Esta é a diferença entre primers de PCR e primers de sequenciamento.
