Key Difference – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green e Taqman são dois métodos empregados para detectar ou observar o processo de amplificação de PCR em tempo real. SYBR Green é um método baseado em corante de coloração de ácido nucleico intercalado, enquanto Taqman é um método baseado em sonda de hidrólise. Ambas as tecnologias são projetadas para gerar fluorescência durante a PCR, o que permite que a máquina de PCR em tempo real monitore a reação em “tempo real”. O método SYBR Green é realizado usando um corante fluorescente chamado SYBR green e detecta a amplificação ligando o corante ao DNA de fita dupla produzido. Taqman é realizado usando sondas duplamente marcadas e detecta a amplificação por degradação da sonda pela Taq polimerase e liberações do fluoróforo. Esta é a principal diferença entre SYBR Green e Taqman.
O que é SYBR Green?
SYBR Green é um corante fluorescente usado para corar ácidos nucleicos, especialmente DNA de fita dupla em Biologia Molecular. O método SYBR Green é usado para quantificar produtos de PCR durante a PCR em tempo real. Uma vez que se liga ao DNA, o complexo DNA-corante resultante absorve a luz azul e emite uma luz verde intensa. Isso acontece devido à mudança estrutural que ocorre na molécula do corante ao se ligar ao DNA de fita dupla. Quando a PCR cria mais e mais DNA, mais moléculas de corante se ligam ao DNA, gerando mais fluorescência. Portanto, a fluorescência aumenta com o acúmulo do produto de PCR. Assim, a quantidade de produto de PCR pode ser medida quantitativamente pela detecção de fluorescência SYBR Green.
O corante verde SYBR também pode ser usado para marcação de DNA em citometria e microscopia fluorescente. O brometo de etídio foi substituído com sucesso pelo SYBR Green, pois o brometo de etídio é um corante cancerígeno com problemas de descarte durante a visualização do DNA na eletroforese em gel.
Existem vantagens e desvantagens do método verde SYBR. Este método é muito sensível, barato e fácil de usar. No entanto, devido à sua capacidade de se ligar a qualquer DNA de fita dupla, a ligação não específica pode levar à quantificação excessiva do produto de PCR.
Figura 01: Técnica SYBR Green
O que é Taqman?
Taqman é um método alternativo ao SYBR Green para monitorar o processo de PCR em tempo real. Este método depende da atividade de exonuclease 5'-3' da enzima Taq polimerase para degradar as sondas durante a extensão da nova fita e liberação de fluoróforo. Sondas duplamente marcadas são usadas neste método e é baseado na hidrólise de sondas. As sondas são oligonucleotídeos de DNA marcados de forma fluorescente com uma molécula repórter fluorescente (fluoróforo) na extremidade 5' e uma molécula supressora na extremidade 3'. Eles são projetados para se ligarem ao molde de fita simples no lado oposto dos recozimentos do primer. A Taq polimerase adiciona nucleotídeos ao primer e estende a nova fita em direção às sondas duplamente marcadas. Uma vez que a Taq polimerase encontra a sonda, a ação exonuclease da Taq polimerase ativa e degrada a sonda. Uma vez concluída a síntese da nova fita, a sonda é submetida à degradação completa e libera o fluoróforo. A liberação de fluoróforo gera fluorescência. A molécula do extintor fluorescente extingue eficientemente a luz emitida e cria a saída para quantificação do produto de PCR. A liberação de fluoróforos e a quantidade de produtos de PCR são proporcionais. Assim, a quantificação pode ser feita facilmente pelo método de Taqman.
Figura 02: Método Taqman
O método Taqman é utilizado em PCR em tempo real, quantificação de expressão gênica, detecção de polimorfismos genéticos, quantificação de deleções de DNA cromossômico, identificação bacteriana, verificação de análise de microarrays, genotipagem de SNP etc.
Qual é a diferença entre SYBR green e Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
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| SYBR Green é baseado no corante de ligação ao DNA. | Taqman dependem de sondas de hibridização e atividade de exonuclease de 5' a 3' da Taq polimerase. |
| Sondas Rotuladas Fluorescentemente | |
| Não são necessárias sondas marcadas com fluorescência. | Sondas com rótulo duplo são necessárias. |
| Análise de genes multiplex | |
| Não pode ser usado para alvos de genes multiplex. | Pode ser usado para alvos de genes multiplex. |
| Custo | |
| Este é mais barato. | Esse é mais caro. |
| Especificidade | |
| Isso é menos específico e se liga a qualquer DNA de fita dupla | Estes são altamente específicos, pois as sondas detectam os produtos de amplificação específicos. |
| Eficácia | |
| Isso é menos eficaz. | Isso é altamente eficaz. |
| Aplicativo | |
| Isso é usado em PCR em tempo real, visualização de gel de agarose, marcação de DNA etc. | É usado em PCR em tempo real, quantificação da expressão gênica, detecção de polimorfismos genéticos, etc. |
Resumo – SYBR Green e Taqman
Taqman e SYBR green são dois métodos empregados em PCR em tempo real (PCR quantitativo). Ambos os métodos permitem a quantificação do produto de PCR de forma eficiente e contam com a emissão da fluorescência. O método Taqman usa sondas duplamente marcadas para detecção do DNA acumulado, enquanto o método SYBR Green usa um corante fluorescente. Ambos os métodos também têm diferentes aplicações em biologia molecular.
