Key Difference – Microarray vs Sequenciamento de RNA
Transcriptoma representa todo o conteúdo de RNA presente em uma célula, incluindo mRNA, rRNA, tRNA, RNA degradado e RNA não degradado. O perfil do transcriptoma é um processo importante para entender os insights celulares. Existem vários métodos avançados para perfis de transcriptoma. Microarray e sequenciamento de RNA são dois tipos de tecnologias desenvolvidas para analisar o transcriptoma. A principal diferença entre o microarray e o sequenciamento de RNA é que o microarray é baseado no potencial de hibridização de sondas marcadas pré-projetadas com sequências de cDNA alvo, enquanto o sequenciamento de RNA é baseado no sequenciamento direto de fitas de cDNA por técnicas avançadas de sequenciamento, como NGS. O microarray é realizado com o conhecimento prévio sobre as sequências e o sequenciamento de RNA é realizado sem o conhecimento prévio sobre as sequências.
O que é Microarray?
Microarray é um método robusto, confiável e de alto rendimento usado para perfis de transcriptoma por cientistas. É a abordagem mais popular para análise de transcrição. É um método de baixo custo, que depende das sondas de hibridização.
A técnica inicia-se com a extração do mRNA da amostra e a construção da biblioteca de cDNA a partir do RNA total. Em seguida, é misturado com sondas pré-projetadas marcadas com fluorescência em uma superfície sólida (matriz de pontos). As sequências complementares hibridizam com as sondas marcadas no microarray. Em seguida, o microarray é lavado e rastreado, e a imagem é quantificada. Os dados coletados devem ser analisados para obter os perfis de expressão relativa.
A intensidade das sondas de microarray é assumida como proporcional à quantidade de transcritos na amostra. No entanto, a precisão da técnica depende das sondas projetadas, do conhecimento prévio da sequência e da afinidade das sondas para hibridização. Portanto, a tecnologia de microarrays tem limitações. A técnica de microarray não pode ser realizada com transcrições de baixa abundância. Não consegue diferenciar isoformas e identificar variantes genéticas. Como este método depende da hibridização das sondas, alguns problemas relacionados à hibridização como hibridização cruzada, hibridização não específica etc. ocorrem na técnica de microarray.
Figura 01: Microarray
O que é sequenciamento de RNA?
RNA shotgun sequenciamento (RNA seq) é uma técnica de sequenciamento completo do transcriptoma desenvolvido recentemente. É um método rápido e de alto rendimento de perfil de transcriptoma. Quantifica diretamente a expressão de genes e resulta em investigação profunda do transcriptoma. RNA seq não depende de sondas pré-projetadas ou conhecimento prévio das sequências. Portanto, o método RNA seq tem alta sensibilidade e capacidade de detectar novos genes e variantes genéticas.
O método de sequenciamento de RNA é realizado através de várias etapas. O RNA total da célula deve ser isolado e fragmentado. Então, usando transcriptase reversa, uma biblioteca de cDNA deve ser preparada. Cada fita de cDNA deve ser ligada com adaptadores. Em seguida, os fragmentos ligados devem ser amplificados e purificados. Finalmente, usando um método NGS, o sequenciamento do cDNA deve ser realizado.
Figura 02: Sequenciamento de RNA
Qual é a diferença entre Microarray e sequenciamento de RNA?
Microarray vs Sequenciamento de RNA |
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| Microarray é um método robusto, confiável e de alto rendimento. | O sequenciamento de RNA é um método preciso e de alto rendimento. |
| Custo | |
| Este é um método de baixo custo. | Este é um método caro. |
| Análise de um Grande Número de Amostras | |
| Isso facilita a análise de um grande número de amostras simultaneamente. | Isso facilita a análise de um grande número de amostras. |
| Análise de Dados | |
| A análise de dados é complexa. | Mais dados são gerados neste método; portanto, o processo é mais complexo. |
| Conhecimento prévio de sequências | |
| Este método é baseado em sondas de hibridização, portanto, é necessário conhecimento prévio das sequências. | Este método não depende do conhecimento prévio da sequência. |
| Variações Estruturais e Novos Genes | |
| Este método não pode detectar variações estruturais e novos genes. | Este método pode detectar variações estruturais, como fusão de genes, splicing alternativo e novos genes. |
| Sensibilidade | |
| Isso não pode detectar diferenças na expressão de isoformas, portanto, tem sensibilidade limitada. | Isso tem alta sensibilidade. |
| Resultado | |
| Isso só pode resultar em níveis de expressão relativos. Isso não fornece a quantificação absoluta da expressão gênica. | Fornece níveis de expressão absolutos e relativos. |
| Reanálise de dados | |
| Isso precisa ser executado novamente para reanalisar. | Os dados de sequenciamento podem ser reanalisados. |
| Necessidade de Infraestrutura e Pessoal Específico | |
| Infraestrutura e pessoal específicos não são necessários para microarray. | Infraestrutura e pessoal específicos exigidos pelo sequenciamento de RNA. |
| Problemas Técnicos | |
| A técnica de microarray tem problemas técnicos como hibridização cruzada, hibridização não específica, taxa de detecção limitada de sondas individuais, etc. | A técnica de seq de RNA evita problemas técnicos, como hibridização cruzada, hibridização não específica, taxa de detecção limitada de sondas individuais, etc. |
| Viés | |
| Este é um método tendencioso, pois depende da hibridização. | O viés é baixo comparado ao microarray. |
Resumo – Microarray vs Sequenciamento de RNA
Os métodos de sequenciamento de microarray e RNA são plataformas de alto rendimento desenvolvidas para perfis de transcriptoma. Ambos os métodos produzem resultados altamente correlacionados aos perfis de expressão gênica. No entanto, o sequenciamento de RNA tem vantagens sobre microarray para análise de expressão gênica. O sequenciamento de RNA é um método mais sensível para a detecção de transcritos de baixa abundância do que o microarray. O sequenciamento de RNA também permite a diferenciação entre isoformas e identificação de variantes de genes. No entanto, o microarray é a escolha comum da maioria dos pesquisadores, já que o sequenciamento de RNA é uma técnica nova e cara com desafios de armazenamento de dados e análise de dados complexa.
