Key Difference – Sequenciamento Sanger vs Pirosequenciamento
O sequenciamento de DNA é muito importante para a análise de DNA, pois o conhecimento do arranjo correto de nucleotídeos em uma determinada região do DNA revela muitas informações importantes sobre ela. Existem diferentes métodos de sequenciamento de DNA. O sequenciamento de Sanger e o pirosequenciamento são dois métodos diferentes de sequenciamento de DNA amplamente utilizados em Biologia Molecular. A principal diferença entre o sequenciamento de Sanger e o pirosequenciamento é que o sequenciamento de Sanger usa didesoxinucleotídeos para encerrar a síntese de DNA para ler a sequência de nucleotídeos, enquanto o pirosequenciamento detecta a liberação de pirofosfato incorporando os nucleotídeos e sintetizando a sequência complementar para ler a ordem precisa da sequência.
O que é o sequenciamento de Sanger?
Sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento de DNA de primeira geração desenvolvido por Frederick Sanger e suas faculdades em 1977. Também é conhecido como sequenciamento de terminação de cadeia ou sequenciamento de dideoxi, pois é baseado na terminação de cadeia por didesoxinucleotídeos (ddNTPs). Este método foi amplamente utilizado por mais de 30 anos até que o Sequenciamento de Nova Geração (NGS) foi desenvolvido. A técnica de sequenciamento de Sanger permitiu a descoberta da ordem correta dos nucleotídeos ou a ligação de um fragmento de DNA particular. Baseia-se na incorporação seletiva de ddNTPs e terminação da síntese de DNA durante a replicação do DNA in vitro. A ausência de grupos 3' OH para continuar a formação de ligações fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes é uma característica única dos ddNTPs. Assim, uma vez que o ddNTP é anexado, o alongamento da cadeia cessa e termina a partir desse ponto. Existem quatro ddNTPs – ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP – usados no sequenciamento Sanger. Esses nucleotídeos interrompem o processo de replicação do DNA quando são incorporados à fita crescente de DNA e resultam em comprimentos variados de DNA curto. A eletroforese capilar em gel é usada para organizar essas fitas curtas de DNA por seus tamanhos em um gel, conforme mostrado na Figura 01.
Figura 1: Eletroforese em gel capilar de DNA curto sintetizado
Para replicação in vitro de DNA, alguns requisitos devem ser fornecidos. Eles são a enzima DNA polimerase, DNA molde, primers oligonucleotídicos e desoxinucleotídeos (dNTPs). No sequenciamento de Sanger, a replicação do DNA é realizada em quatro tubos de ensaio separados, juntamente com quatro tipos de ddNTPs separadamente. Os desoxinucleotídeos não são totalmente substituídos pelos respectivos ddNTPs. Uma mistura do dNTP particular (por exemplo; dATP + ddATP) é incluída no tubo e replicada. Quatro produtos de tubo separados são executados em um gel em quatro poços separados. Em seguida, lendo o gel, a sequência pode ser construída conforme mostrado na Figura 02.
Figura 02: Sequenciamento Sanger
Sequenciamento de Sanger é uma técnica importante que ajuda em muitas áreas da biologia molecular. O projeto do genoma humano foi concluído com sucesso com o auxílio de métodos baseados em sequenciamento de Sanger. O sequenciamento de Sanger também é útil no sequenciamento de DNA alvo, pesquisa de câncer e doenças genéticas, análise de expressão gênica, identificação humana, detecção de patógenos, sequenciamento microbiano etc.
Existem várias desvantagens do sequenciamento de Sanger:
- O comprimento do DNA que está sendo sequenciado não pode ser maior que 1000 pares de bases
- Apenas uma fita pode ser sequenciada por vez.
- O processo é demorado e caro.
Portanto, novas técnicas avançadas de sequenciamento foram desenvolvidas com o tempo para superar esses problemas. No entanto, o sequenciamento de Sanger ainda está em uso devido aos seus resultados altamente precisos até aproximadamente 850 fragmentos de comprimento de pares de base.
O que é Pirosequenciamento?
Pyrosequencing é uma nova técnica de sequenciamento de DNA baseada no “sequenciamento por síntese”. Esta técnica baseia-se na detecção da libertação de pirofosfato após a incorporação do nucleótido. O processo é empregado por quatro enzimas diferentes: DNA polimerase, ATP sulfurilase, luciferase e apirase e dois substratos adenosina 5' fosfosulfato (APS) e luciferina.
O processo começa com a ligação do primer com o molde de DNA de fita simples e a DNA polimerase inicia a incorporação de nucleotídeos complementares a ele. Quando os nucleotídeos se unem (polimerização do ácido nucleico), ele libera grupos pirofosfato (dois grupos fosfato unidos) e energia. Cada adição de nucleotídeos libera uma quantidade equimolar de pirofosfato. O pirofosfato converte-se em ATP pela ATP sulfurilase na presença do substrato APS. O ATP gerado conduz a conversão mediada por luciferase de luciferina em oxiluciferina, produzindo luz visível em quantidades proporcionais à quantidade de ATPs. A luz é detectada por um dispositivo de detecção de fótons ou por fotomultiplicador e cria um pirograma. Apirase degrada ATP e dNTPs não incorporados na mistura de reação. A adição de dNTP é feita uma vez por vez. Uma vez que a adição de nucleotídeo é conhecida de acordo com a incorporação e detecção de luz, a sequência do molde pode ser determinada. O pirograma é usado para gerar a sequência de nucleotídeos da amostra de DNA, conforme mostrado na Figura 03.
Pyrosequencing é muito importante na análise de polimorfismo de nucleotídeo único e sequenciamento de trechos curtos de DNA. A alta precisão, flexibilidade, facilidade de automação e processamento paralelo são as vantagens do pirosequenciamento sobre as técnicas de sequenciamento Sanger.
Figura 03: Pirosequenciamento
Qual é a diferença entre Sequenciamento Sanger e Pirosequenciamento?
Sequenciamento Sanger vs Pirosequenciamento |
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| Sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento de DNA baseado na incorporação seletiva de ddNTPs por DNA polimerase e terminação de cadeia. | Pyrosequencing é um método de sequenciamento de DNA baseado na detecção da liberação de pirofosfato após a incorporação de nucleotídeo. |
| Uso de ddNTP | |
| ddNTPs são usados para terminar a replicação do DNA | ddNTPs não são usados. |
| Enzimas envolvidas | |
| DNA polimerase são usados. | Quatro enzimas são usadas: DNA polimerase, ATP sulfurilase, Luciferase e Apirase. |
| Substratos Usados | |
| APS e Luciferin não são usados. | Adenosina 5' fosfosulfato (APS) e luciferina são usados. |
| Temperatura Máxima | |
| Este é um processo lento. | Este é um processo rápido. |
Resumo – Sequenciamento Sanger vs Pirosequenciamento
Sequenciamento de Sanger e Pirosequenciamento são dois métodos de sequenciamento de DNA usados em biologia molecular. O sequenciamento de Sanger constrói a ordem dos nucleotídeos em sequência, terminando o alongamento da cadeia, enquanto o pirosequenciamento constrói a ordem precisa dos nucleotídeos em sequência por incorporação de nucleotídeos e detecção da liberação de pirofosfatos. Portanto, a principal diferença entre o sequenciamento Sanger e o Pyrosequencing é que o sequenciamento Sanger funciona no sequenciamento por terminação de cadeia, enquanto o pirosequenciamento funciona no sequenciamento por síntese.
