Key Difference – Sequenciamento Maxam Gilbert vs Sanger
Nucleotídeos são as unidades estruturais básicas e blocos de construção do DNA. A molécula de DNA é composta por uma cadeia polinucleotídica. Existem quatro nucleotídeos diferentes encontrados no DNA. Esses nucleotídeos são compostos por quatro bases nitrogenadas diferentes denominadas A (adenina), G (guanina), C (citosina), T (timina). A ordem dos nucleotídeos na molécula de DNA tem grande importância, pois codifica uma importante informação genética para o crescimento e desenvolvimento dos organismos. O sequenciamento de DNA refere-se ao processo que determina a sequência precisa de nucleotídeos do DNA. Existem diferentes métodos de sequenciamento de DNA. O sequenciamento de Maxam Gilbert e o sequenciamento de DNA de Sanger são dois métodos de sequenciamento de DNA que pertencem ao sequenciamento de primeira geração. O procedimento de sequenciamento de Maxam Gilbert determina a sequência de bases clivando quimicamente os fragmentos de DNA marcados na extremidade 5' preferencialmente em cada um dos quatro nucleotídeos e eletroforese em gel. O procedimento de sequenciamento de Sanger determina a sequência de nucleotídeos sintetizando DNA de fita simples usando DNA polimerase e didesoxinucleotídeos e eletroforese em gel. Esta é a principal diferença entre Maxam Gilbert e Sanger Sequencing.
O que é o sequenciamento Maxam Gilbert?
Maxam O sequenciamento de Gilbert, também conhecido como método de sequenciamento químico, é uma técnica que foi desenvolvida para determinar a ordem dos nucleotídeos no DNA. Este método foi introduzido por W alter Gilbert e Alan Maxam em 1976 e tornou-se popular por poder ser realizado diretamente com DNA purificado. O método Maxam Gilbert pertence à primeira geração de sequenciamento de DNA e foi o primeiro método de sequenciamento amplamente utilizado pelos cientistas.
O princípio básico deste método reside na restrição dos fragmentos de DNA marcados na extremidade em bases específicas por produtos químicos e condições específicas de base e separação dos fragmentos marcados por eletroforese, conforme mostrado na figura 01. Os fragmentos são separados de acordo com aos seus tamanhos no gel. Como os fragmentos são marcados, a sequência da molécula de DNA pode ser facilmente deduzida.
O método Maxam Gilbert usa produtos químicos específicos de base para quebrar o DNA em bases específicas. Dois produtos químicos comuns denominados sulfato de dimetilo e produtos químicos de hidrazina são usados para atacar seletivamente purinas e pirimidinas, respectivamente.
O método de sequenciamento Maxam Gilbert é executado através de várias etapas, como segue.
- Purificação da sequência de DNA usando endonucleases de restrição
- Marcação das extremidades dos fragmentos de DNA pela adição de fosfatos radioativos
- Purificação dos fragmentos marcados a partir de fragmentos não marcados por eletroforese em gel
- Separação do DNA marcado na extremidade em quatro tubos e tratamento com produtos químicos específicos de base separadamente
- Eletroforese do conteúdo de cada tubo em linhas separadas em gel e separação dos fragmentos de acordo com seu comprimento.
- Detecção dos fragmentos por autorradiografia.
Figura 01: Sequenciamento de Maxam Gilbert
O que é o sequenciamento de Sanger?
Sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento desenvolvido por Frederick Sanger e seus colegas em 1977 para determinar a sequência de bases de um determinado fragmento de DNA. Também é conhecido como sequenciamento de terminação de cadeia ou método de sequenciamento Dideoxy. Este método funciona com o princípio da incorporação seletiva de didesoxinucleotídeos de terminação de cadeia (ddNTPs), como ddGTP, ddCTP, ddATP e ddTTP pela DNA polimerase durante a síntese de DNA de fita simples para terminar a formação de fita. Os didesoxinucleotídeos não possuem grupos OH 3' para a formação de ligações fosfodiéster com nucleotídeos adjacentes. Assim, a formação da fita para quando um ddNTP é incorporado na fita recém-formada durante o sequenciamento de sanger.
Neste método, quatro reações separadas de síntese de DNA (PCR) são realizadas em quatro tubos separados com um tipo de ddNTP. Outros requisitos também são fornecidos para os tubos para PCR, incluindo primers, dNTPs, Taq polimerase, condições específicas, etc. Quatro reações separadas são realizadas em quatro tubos com quatro misturas. Após as reações de PCR, os fragmentos de DNA resultantes são desnaturados por calor e separados por eletroforese em gel. Em seguida, os fragmentos são visualizados usando um primer marcado (radioativo ou fluorescente) ou dNTPs, conforme mostrado na figura 02.
Figura 02: Sequenciamento Sanger
Qual é a diferença entre Maxam Gilbert e Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sequenciamento Sanger |
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| O sequenciamento de Maxam Gilbert é a primeira técnica desenvolvida para sequenciamento de DNA. | O método de sequenciamento Sanger foi introduzido após o método de sequenciamento Maxam Gilbert. |
| Uso | |
| Este método raramente é usado. | O sequenciamento de Sanger é usado rotineiramente para sequenciamento. |
| Uso de Produtos Químicos Perigosos | |
| Usa produtos químicos perigosos. | O uso de produtos químicos perigosos é limitado em comparação com o método Maxam Gilbert. |
| Rotulagem para detecção | |
| Este método usa P32 radioativo para rotular as extremidades dos fragmentos de DNA. | Sequenciamento Sanger usa ddNTPs marcados radioativamente ou fluorescentemente. |
Resumo – Sequenciamento de Maxam Gilbert vs Sanger
Maxam Gilbert e o sequenciamento de Sanger são dois tipos de técnicas de sequenciamento de DNA que se enquadram no sequenciamento de DNA de primeira geração. O sequenciamento de Maxam Gilbert é o primeiro método introduzido para sequenciamento de DNA em 1976, e é realizado quebrando os fragmentos de DNA marcados na extremidade por produtos químicos de base específica. Por isso, é conhecido como sequenciamento químico. O método de sequenciamento Sanger foi introduzido em 1977 e é baseado nas reações de terminação de cadeia acionadas por ddNTP. Método de sequenciamento Sanger popular do que o método Maxam Gilbert devido a várias desvantagens do método Maxam Gilbert, como consumo excessivo de tempo, uso de produtos químicos perigosos, etc. Esta é a diferença entre o sequenciamento de Maxam Gilbert e Sanger.
