Key Difference – Sequenciamento NGS vs Sanger
Sequenciamento de Nova Geração (NGS) e Sequenciamento Sanger são dois tipos de técnicas de sequenciamento de nucleotídeos desenvolvidas ao longo do tempo. O método de Sequenciamento Sanger foi amplamente utilizado por muitos anos e o NGS o substituiu recentemente devido às suas vantagens. A principal diferença entre o NGS e o Sequenciamento Sanger é que o NGS funciona com o princípio de sequenciar milhões de sequências simultaneamente de maneira rápida através de um sistema de sequenciamento, enquanto o Sequenciamento Sanger funciona no princípio da terminação da cadeia devido à incorporação seletiva de didesoxinucleotídeos pela enzima DNA polimerase durante a replicação do DNA e separação de fragmentos resultante por eletroforese capilar.
O que é sequenciamento de nucleotídeos?
A informação genética é armazenada nas sequências de nucleotídeos do DNA ou RNA de um organismo. O processo de determinar a ordem correta dos nucleotídeos (usando quatro bases) em um determinado fragmento (em um gene, agrupamento de genes, cromossomo e genoma completo) é conhecido como sequenciamento de nucleotídeos. É muito importante em estudos genômicos, estudos forenses, virologia, sistemática biológica, diagnóstico médico, biotecnologia e em muitos outros campos para analisar a estrutura e função dos genes. Existem diferentes tipos de métodos de sequenciamento desenvolvidos por cientistas. Entre eles, o sequenciamento de Sanger desenvolvido por Frederick Sanger em 1977 foi amplamente utilizado e popularizado por um longo período de tempo até que o sequenciamento de próxima geração o substituiu.
O que é NGS?
Sequenciamento de próxima geração (NGS) é um termo usado para se referir aos processos modernos de sequenciamento de alto rendimento. Ele descreve uma série de diferentes tecnologias modernas de sequenciamento que revolucionaram os estudos genômicos e a Biologia Molecular. Essas técnicas são sequenciamento Illumina, sequenciamento Roche 454, sequenciamento Ion Proton e sequenciamento SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Os sistemas NGS são mais rápidos e baratos. Quatro métodos principais de sequenciamento de DNA são usados em sistemas NGS, a saber; pirosequenciamento, sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação e sequenciamento de semicondutores de íons. Um grande número de fitas de DNA ou RNA (milhões de) pode ser sequenciado paralelamente. Ele permite o sequenciamento de todo o genoma dos organismos em um curto período de tempo, ao contrário do sequenciamento de Sanger, que leva mais tempo.
NGS tem muitas vantagens sobre o método Sanger de sequenciamento convencional. É um processo de alta velocidade, mais preciso e econômico que pode ser realizado com um pequeno tamanho de amostra. NGS pode ser usado em estudos metagenômicos, na detecção de variações dentro de um genoma individual devido a inserções e deleções etc. e na análise de expressões gênicas.
Figura_1: Desenvolvimentos no sequenciamento NGS
O que é o sequenciamento de Sanger?
Sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento desenvolvido por Frederick Sanger e seus colegas em 1977 para determinar a ordem precisa de nucleotídeos de um determinado fragmento de DNA. Também é conhecido como sequenciamento de terminação de cadeia ou sequenciamento Dideoxy. O princípio de funcionamento deste método é a terminação da síntese de fita por incorporação seletiva de didesoxinucleotídeos de terminação de cadeia (ddNTPs) como ddGTP, ddCTP, ddATP e ddTTP pela DNA polimerase durante a replicação do DNA. Os nucleotídeos normais têm grupos 3' OH para a formação de uma ligação fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes para continuar a formação da fita. No entanto, os ddNTPs não possuem esse grupo OH 3' e são incapazes de formar ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos. Assim, o alongamento da cadeia é interrompido.
Neste método, o DNA de fita simples a ser sequenciado serve como fita molde para a síntese de DNA in vitro. Outros requisitos são primer oligonucleotídico, precursores desoxinucleotídeos e enzima DNA polimerase. Quando as extremidades flanqueadoras do fragmento alvo são conhecidas, os primers podem ser facilmente projetados para a replicação do DNA. Quatro reações de síntese de DNA separadas são realizadas em quatro tubos separados. Cada tubo tem ddNTPs separados, juntamente com outros requisitos. A partir do nucleotídeo particular, uma mistura de dNTPs e ddNTPs é adicionada. Da mesma forma, quatro reações separadas são realizadas em quatro tubos com quatro misturas. Após as reações, são realizadas a detecção dos fragmentos de DNA e a conversão do padrão do fragmento em informações de sequência. Os fragmentos de DNA resultantes são desnaturados por calor e separados por eletroforese em gel. Se forem usados nucleotídeos radioativos, o padrão de bandas no gel de poliacrilamida pode ser visualizado por autorradiografia. Quando este método usa os didesoxinucleotídeos marcados com fluorescência, ele pode ser mitigado pela leitura do gel e passado por um feixe de laser para ser detectado pelo detector fluorescente. Para evitar erros que possam surgir quando uma sequência é lida a olho nu e inserida manualmente em um computador, este método evoluiu para o uso de sequenciador automatizado acoplado ao computador.
Este é o método usado para sequenciar o DNA do projeto Genoma Humano. Este método ainda está em uso com modificações avançadas porque fornece informações de sequência precisas, apesar de ser um processo caro e lento.
Figura_2: Sequenciamento Sanger
Qual é a diferença entre NGS e Sequenciamento Sanger?
NGS vs Sequenciamento Sanger |
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| Sequenciamento de próxima geração (NGS) refere-se a processos modernos de sequenciamento de alto rendimento. Ele descreve várias tecnologias modernas de sequenciamento | Sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento desenvolvido por Frederick Sanger para determinar a ordem precisa de nucleotídeos de um determinado fragmento de DNA. |
| Efetividade de Custo | |
| NGS é um processo mais barato porque reduz tempo, mão de obra e produtos químicos. | Este é um processo caro porque leva tempo, mão de obra e mais produtos químicos. |
| Velocidade | |
| Isso é mais rápido, pois tanto a detecção química quanto a detecção de sinal de muitas fitas estão ocorrendo paralelamente. | Isso é demorado, pois a detecção química e a detecção de sinal acontecem como dois processos separados e apenas um fio pode ler por vez. |
| Confiabilidade | |
| NGS é confiável. | Sequenciamento Sanger é menos confiável |
| Tamanho da amostra | |
| NGS requer menos quantidade de DNA. | Este método precisa de uma grande quantidade de DNA modelo. |
| Bases de DNA por Fragmento Sequenciado | |
| O número de bases de DNA por fragmento sequenciado é menor que o método de Sanger | As sequências de geração são mais longas que as sequências NGS. |
Resumo – Sequenciamento NGS vs Sanger
NGS e Sanger Sequencing são técnicas de sequenciamento de nucleotídeos amplamente utilizadas em Biologia Molecular. O sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento inicial que foi substituído pelo NGS. A principal diferença entre o sequenciamento NGS e Sanger é que o NGS é um processo de alta velocidade, mais preciso e econômico do que o sequenciamento Sanger. Ambas as técnicas criaram grandes surtos em Genética e Biotecnologia.
