Diferença chave – Northern vs Southern vs Western Blotting
A detecção de sequências específicas de DNA, RNA e proteínas é essencial para diversos tipos de estudos em Biologia Molecular. A eletroforese em gel é uma técnica que separa DNA, RNA e proteínas de acordo com seus tamanhos. A partir dos perfis de gel, uma determinada sequência de DNA, sequência de RNA ou proteína são detectadas por técnicas especiais chamadas blotting e hibridização com sondas marcadas. Existem três tipos diferentes de métodos de blotting, ou seja, sul, norte e oeste. A principal diferença entre o Northern Southern e o Western Blotting está no tipo de molécula que ele detecta em uma amostra. Southern blotting é um método que detecta uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. Northern blotting é uma técnica que detecta uma sequência de RNA específica de uma amostra de RNA. Western blotting é um método que detecta uma proteína específica de uma amostra de proteína.
O que é Southern Blotting?
A técnica Southern blotting foi desenvolvida por E. M. Southern em 1975 para a identificação de uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. Esta é a primeira técnica de blotting introduzida na biologia molecular. Permitiu a detecção de genes específicos do DNA, fragmentos específicos do DNA, etc. Existem várias etapas envolvidas na técnica de Southern blotting. Eles são os seguintes.
- DNA é isolado da amostra e digerido com endonucleases de restrição.
- A amostra digerida é separada por eletroforese em gel de agarose.
- Os fragmentos de DNA no gel são desnaturados em fitas simples pelo uso de uma solução alcalina.
- DNA de fita simples é transferido para uma membrana de filtro de nitrocelulose por transferência capilar.
- O DNA transferido é fixado permanentemente na membrana.
- DNA fixo na membrana é hibridizado com sondas marcadas.
- DNA não ligado é lavado da membrana por lavagem.
- Película de raios-X é exposta à membrana e uma autorradiografia é preparada.
Southern blotting é aplicado para diferentes aspectos da biologia molecular. É útil em mapeamento RFLP, estudos forenses, metilação de DNA na expressão gênica, detecção de genes mutantes em distúrbios genéticos, impressão digital de DNA, etc.
Figura 01: Técnica de Southern Blotting
O que é Northern Blotting?
Northern blotting é um método projetado para detectar uma sequência específica de RNA ou sequência de mRNA de uma amostra para estudar a expressão gênica. Essa técnica foi desenvolvida por Alwine, Kemp e Stark em 1979. Ela difere das técnicas de mancha sul e oeste devido a várias etapas. No entanto, esta técnica também é realizada por eletroforese em gel, blotting e hibridização com sondas marcadas específicas e detecção. A técnica de Northern blotting é realizada da seguinte forma.
- RNA é extraído da amostra e separado por eletroforese em gel.
- RNA é transferido do gel para uma membrana de blotting e fixado.
- A membrana é tratada com uma sonda marcada preparada a partir de cDNA ou RNA (a sonda é complementar a uma sequência específica na amostra).
- A sonda é incubada com a membrana para se ligar a uma sequência específica.
- As sondas não ligadas são lavadas.
- Fragmentos hibridizados são detectados por uma autorradiografia.
Northern blotting é uma ferramenta importante na detecção e quantificação de mRNA hibridizado, estudo da degradação do RNA, avaliação da meia-vida do RNA, detecção de splicing de RNA, estudo da expressão gênica, etc.
Figura 02: Northern Blotting
O que é Western Blotting?
Western blotting é um método de detecção de uma proteína específica de uma mistura de proteínas pelo uso de anticorpos marcados. Portanto, Western blot também é conhecido como immunoblot. Esta técnica foi introduzida por Towbin et al em 1979 e agora é realizada rotineiramente nos laboratórios para análise de proteínas. Os passos são os seguintes.
- Proteínas são extraídas da amostra
- Proteínas são separadas por seus tamanhos usando eletroforese em gel de poliacrilamida
- Moléculas separadas são transferidas para uma membrana de PVDF ou membrana de nitrocelulose por eletroporação
- A membrana está bloqueada para ligação não específica com os anticorpos
- As proteínas transferidas são ligadas ao anticorpo primário (anticorpos marcados com enzimas).
- A membrana é lavada para remover anticorpos primários não especificamente ligados
- Anticorpos ligados são detectados adicionando um substrato e detectando o precipitado colorido formado
Western blotting é útil na detecção de anticorpos anti-HIV em uma amostra de soro humano. Western blot também pode ser usado como teste confirmatório para infecção por hepatite B e teste definitivo para doença da vaca louca.
Figura 03: Western Blotting
Qual é a diferença entre Northern Southern e Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
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| Tipo de Molécula Detectada | |
| Northern Blot | Northern blotting detecta uma sequência de RNA específica de uma amostra de RNA. |
| Manchas do Sul | Southern blotting detecta uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. |
| Western Blotting | O Western blotting detecta uma proteína específica de uma amostra de proteína. |
| Tipo de Gel | |
| Northern Blot | Isso usa gel de agarose/formaldeído. |
| Manchas do Sul | Isso usa um gel de agarose. |
| Western Blotting | Isso usa gel de poliacrilamida. |
| Método de mancha | |
| Northern Blot | Esta é uma transferência capilar. |
| Manchas do Sul | Esta é uma transferência capilar. |
| Western Blotting | Esta é uma transferência elétrica. |
| Sondas Usadas | |
| Northern Blot | sondas de cDNA ou RNA marcadas radioativamente ou não radioativamente. |
| Manchas do Sul | As sondas de DNA são marcadas radioativamente ou não radioativamente. |
| Western Blotting | Anticorpos primários são usados como sondas. |
| Sistema de Detecção | |
| Northern Blot | Isso é feito usando uma autorradiografia, ou detecção de mudança de luz ou cor. |
| Manchas do Sul | Isso é feito usando uma autorradiografia, detecção de luz ou mudança de cor. |
| Western Blotting | Isso é feito usando a detecção de mudança de luz ou cor. |
Resumo – Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting é uma técnica especial desenvolvida para a identificação de DNA, RNA ou proteína específica das amostras. Existem três procedimentos de blotting separados, ou seja, norte, sul e oeste, para detectar um tipo específico de molécula. A técnica de Northern blotting é projetada para detectar uma sequência de RNA específica a partir de uma mistura de RNA. A técnica de Southern blotting permite a detecção de uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA e a técnica de Western blotting é desenvolvida para identificar uma proteína específica de uma mistura de proteínas.
